Białko raka prostaty miało być „nieuchwytne”. Chemicy znaleźli w nim kieszeń

W niemal połowie raków prostaty u mężczyzn europejskiego pochodzenia dochodzi do rearanżacji genów TMPRSS2 i ERG. Powstający w ten sposób układ zmusza komórkę do nadmiernej produkcji onkogennego czynnika transkrypcyjnego ERG. Przez lata był to atrakcyjny, lecz praktycznie niedostępny cel terapeutyczny. Nowa praca w PNAS pokazuje, że ERG ma powierzchnię, do której można przyłączyć małą cząsteczkę.

Z tekstu dowiesz się:

• dlaczego fuzja TMPRSS2 jest jednym z najważniejszych zdarzeń molekularnych w raku prostaty;
• dlaczego czynniki transkrypcyjne tak długo uchodziły za niepodatne na działanie leków;
• jak badacze odkryli kieszeń w domenie PNT białka ERG;
• co PBITE-1 zrobił w komórkach, organoidach i modelach mysich;
• dlaczego PBITE-1 jest na razie sondą molekularną, a nie kandydatem na leczenie pacjentów.

Geny nie zawsze psują się przez mutację jednej litery

Kiedy mówi się o genetyce raka, zwykle wyobrażamy sobie mutację: pojedynczą zmianę w DNA, która uszkadza białko albo nadmiernie je aktywuje.

Rak może jednak przebudować genom w bardziej radykalny sposób.

Fragment chromosomu pęka, zostaje przesunięty i połączony z innym fragmentem. Elementy dwóch genów, które wcześniej działały niezależnie, zaczynają tworzyć nowy układ regulacyjny. W raku prostaty jednym z najczęstszych przykładów jest rearanżacja łącząca TMPRSS2 z ERG.

Nie chodzi przy tym po prostu o sklejenie dwóch pełnych białek.

Najważniejszy efekt polega zazwyczaj na przejęciu kontroli nad ERG przez regulacyjne elementy TMPRSS2. Gen TMPRSS2 jest aktywowany przez receptor androgenowy. Po rearanżacji ten hormonalnie sterowany mechanizm zaczyna napędzać nieprawidłową ekspresję ERG.

Rak podłącza zatem onkogen do przełącznika, który fizjologicznie reaguje na androgeny.

W rezultacie białko ERG pojawia się w komórkach nabłonka prostaty w niewłaściwym miejscu, czasie i ilości. W nowym badaniu autorzy określają tę rearanżację jako zdarzenie obecne w około połowie raków prostaty u pacjentów europejskiego pochodzenia. Wcześniejsze analizy populacyjne wykazywały wyraźnie niższą częstość fuzji w części populacji azjatyckich i afrykańskich, co oznacza, że nie jest to uniwersalna cecha połowy wszystkich raków prostaty na świecie.

ERG nie jest enzymem. Jest menedżerem programu komórkowego

ERG należy do rodziny czynników transkrypcyjnych ETS.

Nie wykonuje jednej łatwej do zablokowania reakcji chemicznej. Wiąże DNA, współpracuje z innymi białkami i zmienia aktywność całych zestawów genów. W komórkach nowotworowych może wspierać programy związane z migracją, inwazją, remodelowaniem chromatyny i zmianą tożsamości komórkowej.

To istotna różnica.

Kinaza nowotworowa przypomina uszkodzony silnik. Ma miejsce wiążące ATP i katalizuje określoną reakcję. Można zaprojektować cząsteczkę, która wejdzie do kieszeni katalitycznej i zatrzyma mechanizm.

Czynnik transkrypcyjny bardziej przypomina dyrygenta.

Sam nie musi wykonywać reakcji enzymatycznej. Organizuje pracę wielu innych elementów. Łączy się z DNA i partnerami białkowymi za pomocą rozległych, stosunkowo płaskich powierzchni. Część jego struktury może być dynamiczna lub nieuporządkowana.

Usunięcie ERG z komórki może silnie zmienić jej zachowanie. Znacznie trudniej znaleźć jednak małą cząsteczkę, która zablokuje go w sposób wystarczająco selektywny.

Dlaczego ERG przez lata nazywano „undruggable”

Klasyczna mała cząsteczka potrzebuje miejsca zaczepienia.

Najlepszym celem jest zazwyczaj wyraźnie uformowana kieszeń: przestrzeń o odpowiednim kształcie, ładunku i właściwościach chemicznych, w której ligand może zostać stabilnie związany.

ERG nie ma aktywności enzymatycznej, którą można byłoby po prostu zahamować. Jego powierzchnie odpowiedzialne za kontakt z DNA i innymi białkami wydawały się zbyt płaskie, rozległe albo dynamiczne, aby klasyczna chemia leków mogła łatwo je wykorzystać.

Słowo „undruggable” nie oznacza jednak, że żaden związek chemiczny nigdy nie będzie w stanie dotknąć danego białka.

Oznacza raczej:

• nie znamy odpowiedniej kieszeni;
• nie umiemy uzyskać wystarczająco silnego i selektywnego wiązania;
• związek nie dociera do właściwego przedziału komórki;
• związanie białka nie przekłada się na zahamowanie jego funkcji;
• efekt przeciwnowotworowy pojawia się dopiero przy toksycznym stężeniu.

Wiele celów określanych jako nieuchwytne okazywało się później podatnych na farmakologiczne działanie, gdy odkrywano przejściowe kieszenie, powierzchnie allosteryczne albo możliwość wykorzystania ligandu do degradacji całego białka.

Nowa praca nie dowodzi, że wszystkie te problemy ERG zostały rozwiązane.

Rozwiązuje pierwszy z nich: pokazuje, że w białku istnieje fizyczna kieszeń, którą można bezpośrednio zaangażować małą cząsteczką.

Samo występowanie fuzji nie wystarcza. Rak nadal musi potrzebować ERG

Zanim zacznie się opracowywać inhibitor, trzeba odpowiedzieć na podstawowe pytanie:

czy zaawansowany nowotwór nadal jest zależny od białka, które uczestniczyło w jego powstaniu?

Nie każdy wczesny czynnik napędzający raka pozostaje równie ważny na późniejszych etapach. W toku ewolucji guza pojawiają się kolejne mutacje i nowe szlaki przeżycia. Zdarzenie inicjujące może stać się biologiczną pamiątką, której zablokowanie nie daje już istotnego efektu.

Badacze wykorzystali komórki VCaP z fuzją TMPRSS2 oraz indukowalny system shRNA, pozwalający obniżyć poziom ERG. Jego wyciszenie powodowało głębokie zahamowanie wzrostu komórek. Autorzy interpretują to jako dowód, że przynajmniej badane modele przerzutowego raka prostaty zachowują zależność od ERG.

To ważniejsze, niż może się wydawać.

Znalezienie kieszeni w białku nie ma wartości terapeutycznej, jeżeli guz potrafi bez tego białka funkcjonować. W tym przypadku badanie łączy dwa elementy:

1. rak pozostaje biologicznie zależny od ERG;
2. ERG ma powierzchnię, którą można chemicznie zaangażować.

Dopiero połączenie tych obserwacji tworzy potencjalny cel terapeutyczny.

ERG nie działa jednak samotnie

Fuzja TMPRSS2 nie jest prostym przełącznikiem, który samodzielnie wyjaśnia cały rozwój raka prostaty.

W modelach eksperymentalnych nieprawidłowa ekspresja ERG współpracuje z innymi zmianami molekularnymi. Jednym z najlepiej opisanych przykładów jest utrata supresora nowotworowego PTEN. Badania na modelach genetycznych wykazały, że ERG i ograniczenie funkcji PTEN mogą wspólnie przyspieszać przejście od zmian przednowotworowych do inwazyjnego raka.

Ma to dwie konsekwencje.

Po pierwsze, ERG może być ważnym sterownikiem programu nowotworowego, ale niekoniecznie jedynym.

Po drugie, odpowiedź na jego inhibitor prawdopodobnie będzie zależała od pozostałej architektury genomowej guza.

Dwa nowotwory z tą samą fuzją mogą różnić się utratą PTEN, zmianami TP53, aktywnością receptora androgenowego, stanem chromatyny oraz zdolnością do przechodzenia w inne fenotypy komórkowe.

W przyszłości samo oznaczenie „ERG-dodatni” może się więc okazać niewystarczające. Potrzebny będzie bardziej precyzyjny profil molekularny wskazujący, które guzy są rzeczywiście uzależnione od aktywności ERG.

Ukryta kieszeń znajduje się w domenie PNT

Autorzy nowego badania nie próbowali celować w całe białko jednocześnie.

Skoncentrowali się na jego N-końcowej domenie PNT, od angielskiego Pointed domain. Jest to uporządkowany fragment obecny w części białek z rodziny ETS, związany między innymi z oddziaływaniami białko–białko.

Badacze przeprowadzili skoncentrowany przesiew związków zdolnych do wiązania domeny PNT. Wykorzystali różnicową fluorymetrię skaningową, czyli metodę pozwalającą obserwować, czy obecność małej cząsteczki zmienia stabilność termiczną badanego białka.

Jeżeli ligand wiąże domenę, może stabilizować albo destabilizować jej strukturę. Zmiana temperatury rozwijania białka stanowi wówczas pierwszy sygnał, że między związkiem a celem zachodzi bezpośrednie oddziaływanie.

Pierwsze trafienie nie było jeszcze końcowym związkiem.

Badacze przeprowadzili optymalizację zależności struktura–aktywność: modyfikowali budowę chemiczną cząsteczki i sprawdzali, które zmiany poprawiają wiązanie oraz aktywność w komórkach. W ten sposób powstał PBITE-1 — PNT-Binding Inhibitor of the Transcription factor ERG.

Nie wystarczy powiedzieć, że związek „wiąże białko”

W badaniach nad trudnymi celami bardzo łatwo uzyskać fałszywie obiecujący wynik.

Związek może agregować. Może destabilizować wiele białek. Może zabijać komórki przez niespecyficzną toksyczność. Może wiązać oczyszczoną domenę w probówce, lecz nie docierać do ERG w żywej komórce.

Dlatego autorzy wykorzystali kilka uzupełniających się metod.

Za pomocą spektroskopii NMR analizowali przesunięcia chemiczne wywołane przez PBITE-1. Pozwoliło to wskazać fragmenty domeny PNT, których środowisko zmieniało się po związaniu związku. Modelowanie molekularne sugerowało, że ligand kontaktuje się z ograniczoną, wystawioną na rozpuszczalnik powierzchnią utworzoną przez dwie helisy alfa i przylegającą elastyczną pętlę.

To właśnie ta powierzchnia stanowi opisaną w pracy kieszeń ligandową.

Nie jest ona klasycznym centrum aktywnym enzymu. Jest miejscem na domenie regulatorowej, którego zajęcie może zaburzać oddziaływania ERG potrzebne do realizowania onkogennego programu.

Badacze wykazali również bezpośrednie zaangażowanie ERG przez PBITE-1 w komórkach. To kluczowy etap: łączy efekt obserwowany na oczyszczonym białku z działaniem wewnątrz biologicznego układu.

Co PBITE-1 zrobił komórkom nowotworowym

W modelach komórkowych PBITE-1:

• ograniczał proliferację;
• zmniejszał zdolność komórek do inwazji;
• indukował apoptozę;
• wykazywał preferencyjną aktywność w nowotworach napędzanych przez ERG.

Efekty obserwowano nie tylko w modelach raka prostaty, ale również w badanych modelach hematologicznych zależnych od ERG.

Ta ostatnia obserwacja ma szersze znaczenie.

ERG uczestniczy również w niektórych nowotworach krwi oraz rearanżacjach występujących poza rakiem prostaty. Kieszeń w domenie PNT nie musi zatem być interesująca wyłącznie dla jednego podtypu jednego nowotworu.

Jednocześnie rozszerzenie zastosowania na inne choroby jest dziś jedynie hipotezą rozwojową. Różne nowotwory mogą wykorzystywać ERG w odmienny sposób, a skuteczne stężenia i toksyczność mogą wyglądać inaczej w każdym kontekście.

Organoidy są ważniejsze niż kolejna płytka z komórkami

Linia komórkowa jest wygodnym modelem, ale ma poważne ograniczenia.

Komórki hodowane przez wiele lat na płaskiej powierzchni podlegają selekcji laboratoryjnej. Tracą część architektury tkankowej i interakcji charakterystycznych dla prawdziwego guza. Związek działający w takiej hodowli może zawieść w bardziej złożonym układzie.

Dlatego autorzy przetestowali PBITE-1 w organoidach raka prostaty.

Organoidy to trójwymiarowe modele odtwarzające część struktury i heterogeniczności tkanki. W badaniu wykorzystano zarówno modele pochodzące od genetycznie zmodyfikowanych myszy, jak i organoidy uzyskane z ludzkich nowotworów.

PBITE-1 silnie ograniczał wzrost organoidów dodatnich pod względem ERG.

To wzmacnia wniosek, że działanie związku nie ograniczało się do jednej linii komórkowej.

Nadal nie jest to jednak odpowiednik badania u pacjentów. Organoid nie odtwarza całego organizmu, metabolizmu leku, układu odpornościowego, bariery naczyniowej ani toksyczności wobec zdrowych tkanek.

Co pokazał model myszy — i czego nie pokazał

Badacze wykorzystali również myszy z ksenoprzeszczepami komórek VCaP.

Po podaniu PBITE-1 stwierdzili istotną indukcję apoptozy komórek nowotworowych. Wynik ten dostarcza farmakodynamicznego dowodu, że związek może dotrzeć do guza w żywym organizmie i wywołać oczekiwany efekt biologiczny.

Nie należy jednak automatycznie tłumaczyć tego jako:

PBITE-1 wyleczył raka prostaty u myszy.

Z abstraktu publikacji nie wynika, by wykazano trwałą regresję guza, zahamowanie przerzutów, przedłużenie przeżycia albo bezpieczeństwo długotrwałego leczenia.

Indukcja apoptozy po krótkiej ekspozycji jest ważnym sygnałem mechanistycznym. Nie odpowiada jeszcze na pytania:

• jak długo efekt się utrzymuje;
• czy guz zaczyna ponownie rosnąć;
• czy pojawia się oporność;
• jakie stężenie można bezpiecznie osiągnąć;
• czy związek działa w modelach o bardziej złożonej heterogeniczności;
• czy toksyczność nie ograniczy dawki.

W badaniach przedklinicznych różnica między „związek zmienia biomarker w guzie” a „związek skutecznie kontroluje chorobę” jest fundamentalna.

PBITE-1 nie jest jeszcze lekiem

Autorzy świadomie nazywają PBITE-1 sondą molekularną.

Sonda ma wykazać, że:

1. określone miejsce w białku może wiązać ligand;
2. związanie następuje również w komórce;
3. zaangażowanie celu zmienia funkcję biologiczną;
4. można uzyskać efekt zgodny z zahamowaniem onkogennego białka.

To właśnie badanie osiąga.

Sonda nie musi jeszcze mieć wszystkich cech leku. Może mieć niedoskonałą rozpuszczalność, krótki czas półtrwania, ograniczoną biodostępność, niewystarczającą selektywność albo parametry chemiczne utrudniające podawanie człowiekowi.

Droga od PBITE-1 do kandydata klinicznego będzie wymagała dalszej chemii medycznej.

Trzeba zwiększyć siłę i selektywność wiązania, zoptymalizować właściwości farmakokinetyczne, zbadać metabolity oraz sprawdzić wpływ na szeroki zestaw innych białek. Konieczne będą również badania toksyczności ostrej i przewlekłej oraz ocena działania w większej liczbie modeli raka prostaty.

Nowa praca nie wprowadza więc terapii.

Wprowadza punkt zaczepienia dla programu odkrywania leków.

Selektywność będzie szczególnie trudna

ERG nie jest białkiem występującym wyłącznie w komórkach raka prostaty.

Pełni ważne funkcje fizjologiczne, zwłaszcza w układzie krwiotwórczym i śródbłonku naczyń. Badania genetyczne wykazały, że ERG jest potrzebny do prawidłowego funkcjonowania hematopoetycznych komórek macierzystych i utrzymania prawidłowej liczby płytek krwi. Inne prace pokazały jego znaczenie dla przeżycia, organizacji połączeń i tworzenia struktur przez komórki śródbłonka.

Bezpośredni inhibitor ERG może więc uderzać jednocześnie w nowotwór i w zdrowe tkanki.

Nie oznacza to, że terapia jest niemożliwa. W onkologii wiele