Obserwacja komórek, tkanek czy wirusów to fundament współczesnej biologii i medycyny. Od dekad jednak naukowcy zderzali się z fizyczną barierą – granicą dyfrakcji światła. Mówiąc prościej, jeśli dwie struktury w komórce leżą zbyt blisko siebie (zazwyczaj poniżej 200 nanometrów), w standardowym mikroskopie świetlnym zlewają się w jedną, rozmytą plamę. Wyobraźmy sobie próbę przeczytania z dużej odległości tekstu napisanego bardzo drobnym drukiem – litery stają się nierozróżnialne. Aby obejść ten problem, stworzono niezwykle zaawansowane i kosztowne mikroskopy super-rozdzielcze.
Co by było jednak, gdyby zamiast budować coraz lepsze „lornetki”, można było po prostu… powiększyć sam tekst? Ta z pozoru szalona idea dała początek technice, która w ciągu ostatniej dekady zrewolucjonizowała obrazowanie w nanoskali, czyniąc je dostępnym dla niemal każdego laboratorium na świecie.
Mikroskopia ekspansyjna – rewolucja w probówce, nie w obiektywie
Mikroskopia ekspansyjna (ExM) to technika chemiczna, która odwraca tradycyjne myślenie o mikroskopii. Zamiast powiększać obraz za pomocą skomplikowanej optyki, fizycznie powiększamy samą próbkę biologiczną. To trochę tak, jakbyśmy nadmuchali balon, na którym wcześniej coś narysowaliśmy – obraz staje się większy, ale jego proporcje pozostają idealnie zachowane. W przypadku ExM „balonem” jest próbka (np. fragment tkanki mózgowej), a „dmuchanie” to kontrolowany proces chemiczny.
Dzięki temu zabiegowi, struktury, które pierwotnie były stłoczone poniżej granicy rozdzielczości, oddalają się od siebie na tyle, że można je zobaczyć za pomocą zwykłego mikroskopu fluorescencyjnego. To przełom, który często nazywa się „super-rozdzielczością dla ubogich”, ponieważ pozwala osiągnąć rezultaty porównywalne z aparaturą wartą miliony, przy użyciu standardowego wyposażenia laboratoryjnego.
Jak „napompować” komórkę? Cztery kroki do nanoświata
Choć brzmi to jak magia, proces ExM opiera się na genialnym w swej prostocie, czterostopniowym protokole. Jego fundamentem jest zastosowanie specjalnego, superabsorbującego polimeru – tego samego, który znajduje się w… pieluchach dla dzieci.
Oto jak przebiega ten proces:
| Krok | Nazwa | Opis działania | Cel |
| 1 | Kotwiczenie (Anchoring) | Do wybranych molekuł w próbce (np. białek) przyczepiane są chemiczne „kotwice”. Mają one zdolność wiązania się z przyszłą siecią polimerową. | Zapewnienie, że interesujące nas struktury zostaną unieruchomione i nie zgubią się podczas dalszych etapów. |
| 2 | Infiltracja i polimeryzacja | Próbka jest nasączana roztworem monomerów (cegiełek budujących polimer). Następnie inicjuje się reakcję polimeryzacji, w wyniku której wewnątrz komórek i tkanek tworzy się gęsta, przezroczysta siatka polimerowa, połączona z wcześniej dodanymi kotwicami. | Stworzenie „rusztowania”, które utrzyma molekularną architekturę próbki w nienaruszonym stanie. |
| 3 | Homogenizacja (Softening) | Za pomocą enzymów, detergentów lub wysokiej temperatury trawi się i rozkłada oryginalne struktury biologiczne próbki, pozostawiając jedynie molekuły zakotwiczone w polimerowej siatce. | Usunięcie biologicznego „szkieletu”, który ograniczałby swobodne rozszerzanie się żelu. Próbka staje się niezwykle elastyczna. |
| 4 | Pęcznienie (Swelling) | Próbkę umieszcza się w czystej wodzie. Cząsteczki wody wnikają w hydrożel, powodując jego równomierne (izotropowe) pęcznienie we wszystkich kierunkach. Próbka może zwiększyć swoją objętość nawet 100-krotnie, stając się przy tym niemal idealnie przezroczysta. | Fizyczne oddalenie od siebie zakotwiczonych molekuł, co pozwala na ich zobrazowanie ze znacznie wyższą rozdzielczością. |
Po zakończeniu procesu, napęczniała próbka jest gotowa do analizy pod standardowym mikroskopem. Gołym okiem jest niemal niewidoczna, przypomina eteryczną meduzę unoszącą się w roztworze. Dopiero pod mikroskopem ukazuje swoje bogactwo z niespotykaną dotąd szczegółowością.
Od uniwersalnego narzędzia do wyspecjalizowanych rozwiązań
Piękno mikroskopii ekspansyjnej leży w jej elastyczności. Choć podstawowe cztery kroki pozostają niezmienne, naukowcy na całym świecie modyfikują i udoskonalają tę technikę, dostosowując ją do konkretnych wyzwań badawczych.
-
U-ExM (Ultrastructure Expansion Microscopy): Zoptymalizowana wersja protokołu, która pozwala na jeszcze lepsze zachowanie delikatnych ultrastruktur komórkowych, takich jak centriole – kluczowe organella odpowiedzialne za podziały komórkowe. Dzięki U-ExM odkryto zupełnie nowe, nieznane wcześniej formy cytoszkieletu u mikroalg.
-
ONE (One-step Nanoscale Expansion): Najnowsza odsłona techniki, która w połączeniu z zaawansowaną analizą obrazu opartą na sztucznej inteligencji, pozwala osiągnąć niemal atomową precyzję obrazowania.
-
Integracja z innymi technikami: ExM stała się platformą do łączenia różnych typów danych. Połączono ją na przykład z sekwencjonowaniem RNA (Expansion Sequencing), co pozwala tworzyć trójwymiarowe mapy ekspresji genów w nanoskali, np. w pojedynczych synapsach w mózgu. Inni badacze wykorzystują ją do tworzenia „konektomów” – kompletnych map połączeń neuronalnych.
Z laboratorium do kliniki – diagnostyka i terapia nowej generacji
Potencjał ExM wykracza daleko poza badania podstawowe. Coraz śmielej wkracza ona na pole medycyny, otwierając nowe możliwości w diagnostyce i terapii.
-
Diagnostyka chorób neurodegeneracyjnych: Wykazano, że ExM może być użyta do analizy płynu mózgowo-rdzeniowego pacjentów z chorobą Parkinsona, pozwalając na odróżnienie szkodliwych agregatów białkowych od tych nieszkodliwych. To może być krok w stronę wczesnego wykrywania choroby.
-
Onkologia i nefrologia: Analiza biopsji nowotworowych czy próbek nerek za pomocą ExM pozwala zobaczyć zmiany w architekturze komórek i interakcje między nimi (np. między komórkami odpornościowymi a komórkami guza) z precyzją niemożliwą do osiągnięcia standardowymi metodami patologicznymi.
-
Terapie celowane: ExM jest wykorzystywana do oceny skuteczności terapii genowych. Obserwując zmiany strukturalne w komórkach oka po podaniu leku, badacze mogą precyzyjnie dostroić protokół leczenia, by zmaksymalizować jego efektywność i bezpieczeństwo.
Minęła dekada od pierwszej publikacji, a mikroskopia ekspansyjna wciąż się rozwija, stając się fundamentem dla coraz bardziej ambitnych projektów. Demokratyzuje dostęp do nanoświata, łącząc dziedziny i inspirując naukowców do zadawania pytań, na które jeszcze niedawno nie można było znaleźć odpowiedzi. A co najważniejsze, wciąż jest tu „wiele miejsca na robienie naprawdę fajnych rzeczy”.
Pomysł na doktorat
Tytuł projektu: Zastosowanie ultrastrukturalnej mikroskopii ekspansyjnej (U-ExM) do wczesnej identyfikacji i charakteryzacji strukturalnych biomarkerów chorób neurodegeneracyjnych w płynach ustrojowych.
Hipoteza badawcza: Wczesne stadia chorób takich jak Alzheimer czy Parkinson charakteryzują się powstawaniem specyficznych, strukturalnie odmiennych agregatów białkowych (np. oligomerów alfa-synukleiny lub białka tau) w płynie mózgowo-rdzeniowym i osoczu krwi. Zastosowanie zoptymalizowanej techniki U-ExM pozwoli na ich wizualizację, ilościową ocenę i odróżnienie od form fizjologicznych, co umożliwi stworzenie nowej, nieinwazyjnej metody wczesnej diagnostyki.
Cele badawcze:
-
Opracowanie i optymalizacja protokołu U-ExM do analizy próbek płynnych (płyn mózgowo-rdzeniowy, osocze).
-
Zaprojektowanie i walidacja specyficznych sond molekularnych (kotwic i znaczników fluorescencyjnych) dla kluczowych białek neurodegeneracyjnych.
-
Zobrazowanie i analiza ilościowa ultrastruktury agregatów białkowych w próbkach od pacjentów we wczesnym stadium choroby w porównaniu do grupy kontrolnej.
-
Skorelowanie uzyskanych danych strukturalnych z danymi klinicznymi w celu oceny potencjału diagnostycznego i prognostycznego metody.
Nowatorstwo projektu: Projekt łączy najnowsze osiągnięcia w dziedzinie mikroskopii ekspansyjnej z palącą potrzebą kliniczną, jaką jest wczesna diagnostyka chorób neurodegeneracyjnych. Zamiast mierzyć jedynie stężenie biomarkerów, proponuje analizę ich nanostruktury, co może dostarczyć znacznie bardziej precyzyjnych informacji o patogenezie choroby.
Jak zobaczyć niewidzialne? Poznaj technologię, która pompuje komórki, by odkryć tajemnice życia i chorób by www.doktoraty.pl